جداسازی ژن های hxt2 و hxt3 از مخمرsaccharomyces cerevisiae سویه ایرانی و کلونینگ آنها در وکتور بیانی مخمر

تولید سوخت زیستی اتانول، یکی از کاربردهای تجاری فناوری های مهندسی میکروارگانیسم ها با استفاده از تخمیر الکلی گلوکز است. گلوکز در مخمر saccharomyces cerevisiaeبا فعالیت پروتئین های خانواد ه انتقال دهنده هگزوز، وارد سلول شده و از طریق تخمیر به سوخت زیستی اتانول تبدیل می شود. از میان مهم ترین انتقال دهنده های هگزوز، هگزوز ترنسپورتر 2 (hxt2) و هگزوز ترنسپورتر 3 (hxt3) انتخاب شدند. به منظور انجام مطالعات مولکولی بر روی hxt2 و hxt3 در مخمر cerevisiae s. سویه ایرانی و آماده نمودن زمینه برای افزایش بیان این ژن ها اقدام به جداسازی و کلونینگ dnaی ژن کد کننده ی hxt2 و hxt3 گردید. برای این منظور استخراج dna از سلول های رشد یافته مخمر بر روی محیط کشت مایع ypd انجام شد. پس از تکثیر قطعات مورد نظر بوسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز، قطعات تکثیر شده در وکتور پایه pgem-t کلون گردید. سپس به باکتری e. coli منتقل و باکتری های تراریخته با روش blue - white گزینش شدند. ابتدا از کلونی های سفید pcr روی کلونی انجام و پس از استخراج پلاسمید از کلونی های مثبت، pcr روی پلاسمید صورت گرفت. پلاسمیدهای با پاسخ مثبت بعد از تائید با هضم آنزیمی برای تائید نهایی تعیین توالی شدند. با تائید صحت توالی ژن های hxt2 و hxt3، جهت قرارگیری در وکتور بیانی مناسب، این ژن ها با پرایمرهای مجهز به سایت های برشی آنزیم های smai و psti تکثیر شدند و بعد از برش، در وکتور بیان pgbkt7کلون گردیدند. پس از انتقال وکتور نوترکیب حاصل به باکتری e. coli از کلونی های رشد یافته در محیط گزینشی کانامایسین pcr صورت گرفت. استخراج پلاسمید از کلونی های تائید شده، جهت انجام pcr روی پلاسمید و هضم آنزیمی و توالی یابی مجدد انجام شد. نتایج بدست آمده صحت کلونینگ ژن های مورد نظر را در وکتور بیانی نشان می دهند. وکتور نوترکیب ایجاد شده برای انتقال به مخمر در جهت افزایش بیان و نتیجتاً تسهیل مسیر تولید سوخت زیستی استفاده خواهد شد.